NGS接龙丨恒特基因首席科学家郑宗立：专注肿瘤测序，加速技术创新

兴趣指引方向，铺就NGS之路

第一次接触NGS是在2008年，正值我于瑞典卡罗林斯卡学院（Karolinska Institute）攻读医学流行病学博士。在当时，瑞典国家传染病研究所引入了瑞典第一台罗氏454测序系统，并利用其进行了大量的微生物测序工作。近水楼台先得月，凭借当时的便利条件，我也得以接触到了早期的NGS技术和二代测序平台。

俗话说，兴趣是最好的老师，古往今来人们开始探索，都起源于对自然万物的惊异，以好奇的目光往往可以看到更深远的事物。测序技术的发展为生命科学带来了新的可能，与同时代的其他“全基因组”方法相比，NGS技术具有强大的性能，其对生物本质的DNA信息的呈现能力大大超过同时代的其它众多生物技术，极具潜力，具有广阔的应用前景，对推动生命科学领域的发展有着重要的意义。虽然当时我并非专门进行测序的研究，但是在跟测序打交道的过程中，逐渐对其产生了浓厚的兴趣，并渐渐为之着迷。

早期的NGS技术在稳定性上存在很多缺陷，同时实验室内的操作流程也极为复杂、繁琐，很容易出现各类技术问题。凭借着我在生物信息学以及统计学的背景，并结合早期二代测序的原理，在当时对其进行了深入的研究，提出了运用泊松分布来预测反应单元中分子的重复率，并针对罗氏454测序系统开发了众多实验室新方法，省去了实验过程中不必要的环节，使其操作更加简单的同时使其产出更多高质量的测序数据。相关的研究在当时发表于Nat Protoc上，直至今日仍有很多公司在使用。

肿瘤病理、靶向治疗以及NGS的融合发展

博士毕业之后，我思考着未来的方向。在当时，我的脑海中有三个关键词：肿瘤病理、靶向治疗以及NGS，这三者若能结合在一起，必将成为未来的发展方向。恰逢N Engl J Med发表了麻省总医院的一篇文章，麻省总医院当时在肿瘤靶向治疗领域处于世界前沿，这篇文章为FDA批准针对肺癌的第二个靶点ALK基因融合的靶向治疗奠定了基础。当时也恰逢Ion Torrent测序平台刚刚推出，麻省总医院也引进了这一测序平台。于是我与它们取得了联系，并一拍即合，一个月之后我便来到了其实验室进行这方面的研究。

我的研究一直瞄准于NGS的临床应用，而肿瘤分子诊断中最大的困难就是FFPE样本自身的局限性，样品中的DNA和RNA常常有模板断裂、模板损坏等问题，不但限制了一些检测方法的应用，而且测序结果中往往含有很多错误。基于这样的局限性，我们对技术进行了创新研发，针对医院的临床需求发明了基于二代测序的肿瘤分子检测AMP（Anchored multiplex PCR，锚定多重PCR）技术，现已被广泛应用于美国临床和科研，结果发表在Nat Med杂志上，目前已经成为麻省总医院主要的分子病理检测方法。AMP是一种为NGS生成富集目标序列文库的快速、简单、易扩展的方法。该技术可用于FFPE中的RNA、基因组DNA进行富集测序，可在数小时内轻松建成测序文库，且适用于各种类型及质量参差不齐的临床样本，特别是微量核酸样本，其构建的目标基因二代测序文库优于传统的多重PCR制备文库。AMP是在2012年完成实验设计，2013年进行大规模的临床验证。其间，Foundation Medicine于2013年在Nat Biotechnol 上发表了他们的方法，我当时感到压力很大。据我所知，对于基因融合的检测，虽然有很多方法对某些样品、某些融合变异也能检测出来，但是至今没有其它方法像AMP这样，有系统性地大规模的临床FFPE样本验证，并达到100%的灵敏度和100%的特异度。正因为这样的结果，我的导师John Iafrate（以前为FDA编写FISH法检测基因融合的标准实验流程）在自己的实验室已经全面将FISH法替换成了AMP法了（FISH法至今仍是众多实验室的金标准）。

在麻省总医院的研究中，除了对实验环节进行技术优化，针对测序数据，我也从实验设计者的角度对其数据分析进行了优化，使生物信息学的软件更加灵敏。在我离开实验室时，应用AMP参与的一项发表在N Engl J Med研究结果为FDA批准针对肺癌的第三个靶点ROS1基因融合的靶向治疗奠定了基础。

抓住“小鲨鱼”，放过“小金鱼”

早发现、早干预、早治疗是癌症防治的黄金守则，肿瘤的早期筛查是降低肿瘤的死亡率的重要措施。液态活检技术不仅在对肿瘤患者进行用药指导、疗效跟踪、复发监测方面相比传统的肿瘤检测方法如侵入性的组织活检方法具有明显的优势，并且在肿瘤早筛方向有着很好的应用前景。然而，早期癌组织释放到血液中的突变游离DNA（cfDNA）占血液中总游离DNA的比例常常很低，千分之一甚至更低，且驱动肿瘤生长的基因众多。因此，肿瘤cfDNA检测必须同时满足多基因和高灵敏度两个技术要求，这是液态活检技术在肿瘤早筛领域需要突破的一道技术障碍。

液态活检发展至今，已经取得了一些令人兴奋的结果，同时也面临着巨大的挑战。目前包括Grail在内的多家公司对此方面花费大量研发精力，期望早日解决液态活检在肿瘤早期检测应用中的关键问题，并最终减低癌症死亡率。

回国后，我联合几位创始人创办了恒特基因。恒特基因目前专注于肿瘤精准检测的关键技术，应用于癌症的精准治疗和早期筛查，积极开展肿瘤防治的工作。

大鱼是从小鱼长大的。大型的肿瘤测序研究如TCGA和ICGC对“大鱼”作了详尽的分析，为我们及时找到未成气候的、游离的“小鱼”提供线索 。将肿瘤细分并打个比方，按良恶性分成恶性肿瘤（鲨鱼）和良性肿瘤（金鱼），按时间进展分成小鱼（如存在于血液中的肿瘤的蛛丝马迹）和大鱼（临床肿瘤）。你也许会说青蛙是从蝌蚪成长起来的，长大了就变了，但是，即使蝌蚪的形态变化了，其注定成长青蛙的基因没有发生变化。早期筛查的一个关键是找到小鲨鱼，放过小金鱼。如果是肿瘤注定是恶性的，就应该积极采取行动，不要等到变成大鲨鱼了就晚了，然而这种遗憾时不时都在发生。反过来，如果是小金鱼，应该避免过度诊断，避免比如因人群乳房造影筛查和前列腺特异抗原筛查的阳性结果，而进行的不必要的组织抽样，所造成的身体伤害和焦虑（所谓“不作死就不会死no zuo no die”）。如何正确区分小鲨鱼和小金鱼，如何区分小鲨鱼的地域品种（肿瘤组织来源），还要依赖前瞻性的人群大规模研究来进一步论证或揭示：哪些基因的变异与肿瘤的发生有关；哪些基因的变异是不同原位组织的特征；哪些基因的变异与肿瘤的良恶程度有关—我们都拭目以待。

来源：测序中国

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